美高梅官方appScience新年发文:基因疗法时代即将到来 挑战不容忽视

大约五十年前,科学家假设,外源DNA的遗传修饰可能对遗传性人类疾病的治疗有效。基因疗法通过将遗传物质导入细胞补偿或纠正异常基因,引入的正常基因拷贝能够帮助恢复必需蛋白质的功能。这种“基因治疗”策略为后续研究提供了理论基础,即通过一次治疗就可以获得持久且有效的临床治疗。基因疗法的发展之路漫长而曲折,在早期临床研究中遇到的严重不良反应,促使基因治疗研究转向更安全、更有效的基因转移载体。经过三十年探索,通过修改DNA来治疗疾病的基因治疗方法不再是未来医学,而是当今临床治疗工具的一部分,正在为医学领域带来多个新的治疗选择。基因疗法现在被认为是治疗多种人类疾病的有效方法。2017年一系列令人鼓舞的临床结果显示,基因疗法在血友病、镰状细胞病、失明、几种严重的遗传性神经退行性疾病以及骨髓和淋巴结多发癌等疾病的治疗中均取得了重大进展。1月12日,国立卫生研究院心肺血液研究所血液学分部的CynthiaE.Dunbar教授等人在Science共同发表了一篇回顾性文章“Genetherapycomesofage”,文章回顾了目前基因疗法领域的开创性工作,描述了在该领域内发挥重要作用的基因编辑技术,并讨论了基因疗法应用于临床时面临的实际挑战。从病毒载体到基因组编辑AAV基因治疗血友病的历史综述1996年,美国国立卫生研究院专家组认为,令人失望的临床结果是由于对病毒载体、靶细胞和组织及疾病的生物学知识不足所致。专家组建议研究人员重返实验室,重点研究基础医学科学,由此引发了研究界对新载体的开发和对靶细胞的深入了解。20世纪80年代和90年代早期开发的γ-逆转录病毒载体是第一个被证明能够将基因递送至重建HSC细胞。目前,逆转录病毒和腺伴随病毒已经显示了良好的临床前景。在先天性失明、血友病B和脊髓性肌萎缩患者体内,AAV载体可以将正常基因递送至视网膜、肝脏和神经系统等部位,并取得一定的临床改善。美国FDA已经批准了第一个矫正型基因疗法产品Luxturna上市,用于治疗儿童及成人的遗传性视网膜病变。与只能介导一种类型的基因修饰的病毒载体相反,新的基因组编辑技术可以介导基因加入、切除、校正以及其他靶向基因组修饰,为纠正或改变基因组提供了精确的解剖刀。其中应用最广泛的是CRISPR-Cas9技术,它没有自身的应用限制,可以有效切割特定DNA序列,也可以通过基于Cas9的“碱基编辑”靶向修正单碱基水平的突变。基因组编辑方法还可以克服许多依靠病毒载体介导的半随机基因组插入策略的缺点。如,对附近原癌基因的异位激活,肿瘤抑制基因的敲除或者正常剪接扰动引起的遗传毒性等。体外基因递送:CAR-T疗法CAR-T细胞疗法的历史概述基因疗法最初被设想为一种仅治疗遗传性疾病的疗法,现在正被应用于癌症等后天获得性疾病,如改造淋巴细胞、白细胞等可靶向杀伤癌细胞的细胞。这一概念通过基因工程T细胞在肿瘤免疫治疗中的应用解释,近期的临床研究发现,CAR-T疗法的单次输注可以在部分患者中产生持久的治疗效果。CAR-T疗法同样有50多年的研究历程,正在逐渐成为癌症的强效“药物”,该疗法是从个体患者的体内收集并提取T细胞,在体外进行基因改造,使T细胞能够靶向杀伤癌细胞,当这些T细胞改造完成后,会被输注回患者体内进行治疗。2017年8月31日,FDA正式批准Novartis的CAR-T疗法CTL019上市,用于治疗复发或难治性儿童和年轻成人B细胞急性淋巴细胞白血病,CTL019是FDA批准的首款CAR-T疗法和第一个基因治疗药。目前研究的CAR-T疗法已经扩展到了骨髓恶性肿瘤和实体瘤,而面临的挑战是还未找到可靠的肿瘤特异性细胞表面抗原。需要注意的是,CAR-T疗法可能产生严重的全身不良反应,包括肿瘤外效应、细胞因子释放综合征以及神经毒性等,甚至导致患者死亡,往往需要重症监护。研究人员需要着重关注减轻和治疗这些并发症。此外,研究人员还需要帮助CAR-T细胞进入肿瘤或免疫特异性位点,并找到解除肿瘤微环境信号的方法,防止T细胞的“武装被解除”。与传统的自体CAR-T疗法不同,通用型CAR-T疗法则可以实现更快速和更便宜的治疗,可以对异体T细胞进行提前制备,随时提供给患者。并且,它也不受患者自身T细胞质量的影响。在过去一年中,基因编辑、基因疗法等基因治疗的科学研究报道了多项临床试验的成熟数据,证明了在各种严重人类疾病中基因疗法的有效性和安全性。在学术科研中进行的概念证明和临床研究中的疗效验证的基础上,基因治疗正在加速临床和商业的发展。科研人员通过与生物技术、制药公司建立合作伙伴关系,不断扩大专业知识,从以学术为基础的“家庭工业生产”转变为工业药物开发,将对人类疾病治疗产生更广泛的影响。但基因疗法的临床应用仍然存在许多挑战,包括将基因转移或编辑效率提高到有效治疗疾病所必需的水平,处理重复体内给予载体的免疫应答,并就社会争议问题达成共识。此外,与包括政府和保险公司在内的医疗报销机构合作开发新报销模式也很重要。总之,基因治疗具有为人类健康提供长久益处的潜力,过去几年的科学进步和临床成就表明,这种疗法终将成为治疗严重人类疾病的重要部分。参考文献:1.Genetherapycomesofage2.Thecomingofageofgenetherapy:Areviewofthepastandpathforward原标题—Science新年发文:基因疗法时代即将到来,挑战不容忽视

2017年,对于基因治疗领域来讲,注定是不平凡的一年,自8月份,诺华的突破性CAR-T疗法Kymriah获得FDA批准,几周后,Kite
Pharma的CAR-T疗法Yescarta也获得批准。之后没多久,Spark
Therapeutics的基因疗法Luxturna也在12月份获批上市。本文将重点盘点2017年在基因治疗领域有突出成绩的国外企业。

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美高梅官方app,本文转载自“药明康德”。

2017 获批的两款“ex vivo”基因疗法

近两年来,基因疗法领域取得了重大突破,2017年底,明星基因疗法公司Spark
Therapeutics开发的Luxturna获得FDA批准上市,成为首款在美国获批的“体内给药型”基因疗法。而诺华公司开发的Zolgensma也有望在本月获得FDA批准,成为第二款“体内给药型”基因疗法。根据再生医学联盟发布的报告,截至到2019年第一季度末,全球有371项基因疗法处于临床开发阶段,与2018年同期相比,增长了17%。

1、诺华的突破性CAR-T疗法Kymriah

作为递送基因疗法的有力工具,腺相关病毒的开发和制造也成为业界的关注焦点之一。近日多家公司通过合作和并购,扩展AAV的设计和制造能力。日前,Nature
Reviews Drug
Discovery上发表一篇综述,通讯作者是马萨诸塞大学医学院的基因疗法专家高光坪教授。这篇综述对这一基因疗法递送平台进行了详细介绍,今天药明康德的微信团队将与读者分享这篇文章的精彩内容。

突破性CAR-T疗法Kymriah(tisagenlecleucel,曾用名CTL019),用于治疗罹患B细胞前体急性淋巴性白血病,且病情难治,或出现二次及以上复发的25岁以下患者。此前,Kymriah曾获得美国FDA颁发的突破性疗法认定,优先审评资格,以及快速通道资格。

腺相关病毒基本构造和作为基因疗法载体的运作机理

Kymriah是一款有望为这些患者群体带来福音的突破性疗法。作为一款需要基因改造的自体T细胞免疫疗法,Kymriah的治疗需要先从个体患者的体内提取出T细胞,并在生产中心进行遗传改造。这些T细胞会被引入全新的嵌合抗原受体,使T细胞有能力直接靶向并杀伤带有CD19抗原的白血病细胞。当这些T细胞改造完成后,就会被输注回患者体内,进行治疗。

腺相关病毒是一种单链DNA病毒,目前的科学界共识是它不会导致任何人类疾病。它由蛋白衣壳和长度为4.7kb的单链DNA基因组构成。蛋白衣壳由三个亚基组成,分别为VP1,VP2,和VP3。AAV基因组两端为两个“T”型的末端反向重复序列。这两个ITRs是病毒DNA复制的起点和触发病毒包装的信号。AAV基因组中的rep基因编码4个与病毒复制相关的蛋白,分别为Rep78、Rep68、Rep52、和Rep40。

2、Kite Pharma的CAR-T疗法Yescarta

作为基因疗法载体的重组腺相关病毒携带的蛋白衣壳与野生型AAV几乎完全相同,然而衣壳内的基因组中编码病毒蛋白的部分完全被删除,取而代之的是治疗性转基因。AAV基因组中唯一被保留的部分是ITRs,它起到指导基因组的复制和病毒载体组装的作用。将编码病毒蛋白的部分完全删除的优点是:一方面可以最大化重组AAV携带转基因的容量,另一方面减小体内递送转基因时产生的免疫原性和细胞毒性。

CAR-T疗法Yescarta(axicabtagene
ciloleucel),用于治疗罹患特定类型的大B细胞淋巴瘤成人患者。这些患者曾接受了至少两次其他治疗,但没有出现缓解,或是疾病出现复发。这是美国FDA批准的首款针对特定非霍奇金淋巴瘤的CAR-T疗法,也是第二款获批的CAR-T疗法。美国FDA曾授予它孤儿药资格,突破性疗法认定,以及优先审评资格。

▲重组AAV载体介导转基因表达的过程

Spark Therapeutics

重组AAV颗粒通过与宿主细胞表面表达的糖化受体相结合,通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞。在内吞形成的内体酸化之后,病毒衣壳的VP1/VP2部分构象发生变化,导致病毒从内体中脱离,并且通过核孔进入细胞核。进入细胞核后,单链DNA从衣壳中释放出来。这时单链DNA还不能进行转录,它们需要变成双链DNA。单链DNA可以利用宿主细胞的DNA聚合酶来合成互补链,或者两条从不同AAV颗粒中释放的互补链退火形成双链DNA。

“使生命不受遗传疾病限制”

最新的AAV基因组设计能够将衣壳中携带的单链DNA设计成自我互补的序列。这种序列的优点在于它不需要单链DNA复制成为双链DNA的步骤就可以进行转录,与传统的单链AAV基因组相比,它的基因表达更为迅速,而且表达量更高。诺华公司开发的治疗脊髓性肌肉萎缩症的Zolgensma就使用了这种基因组设计。然而这种设计的一个缺点是AAV携带的转基因容量减半。

2017年12月,美国公司Spark
Therapeutics的基因疗法Luxturna获批上市,用于治疗患有特定遗传性眼疾的儿童和成人患者。这是首款在美国获批、靶向特定基因突变的“直接给药型”基因疗法。与诺华的Kymriah和Kite
Pharma的Yescarta不同,Spark
Therapeutics的Luxturna更符合人们对基因疗法的想象——通过注射,腺相关病毒载体将健康的基因送入所需的人体细胞内,合成具有正常功能的蛋白。

双链形式的AAV基因组然后利用ITRs进行分子内或分子间基因组重组,这一过程让AAV基因组成为稳定的游离DNA,导致基因组能够在不再进行有丝分裂的细胞中持续进行基因表达。

美国公司Spark
Therapeutics成立于2013年3月,是一家上市的临床阶段基因治疗公司。基于费城儿童医院二十多年积累的技术和经验,Spark
Therapeutics旨在通过发展潜在的一次性改变生命的治疗减轻遗传疾病,改善患者的生活。对基因组和遗传异常的了解,使得这家公司能够针对特异性遗传疾病的患者定制研究疗法。

AAV载体的转化应用

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截至2018年11月13日,在ClinicalTrials.gov上有145项干预性临床试验中使用重组AAV载体。目前,两款重组AAV载体已经获得批准在患者身上使用,它们是uniQure公司开发的Glybera和Spark
Therapeutics公司开发的Luxturna。而诺华公司开发的Zolgensma可能在本月加入获批疗法的行列。

Spark Therapeutics的研发管线

目前,大约有10来种不同血清型的AAV在临床试验中作为基因疗法的载体,基于AAV2的基因递送平台虽然仍然是最多的,但是诸如AAV8,AAV9和AAVrh.10等新一代衣壳正在临床试验中得到更多应用。下面我们来看一看这些临床试验的特征。

成立初期,Spark
Therapeutics曾获得美国费城儿童医院投资的5千万美元的A轮融资。2014年,这家公司再次获得Sofinnova
Ventures领投的7280万美元B轮融资。2015年,Spark走进美国纳斯达克,正式登陆资本市场。

▲干预性AAV基因疗法临床试验简介

Spark
Therapeutics已经建立了一个领先的综合基因治疗平台,将遗传疾病患者的基因转化为药物,包括遗传性视网膜疾病、肝脏介导疾病、神经退行性疾病,研发管线中的每个研究项目都是Spark团队及其合作者开发和制造的腺相关病毒载体。

重组AAV载体递送基因的靶向组织

UniQure

大部分基因疗法研发项目的靶向组织是肝脏、横纹肌和中枢神经系统。几乎所有天然AAV衣壳蛋白能够在肝脏中引发有效的转基因表达,因此靶向肝脏的重组AAV为治疗一系列疾病提供了优良的基因递送平台。它们包括A型和B型血友病、家族性高胆固醇血症等疾病。

“我们的愿景是提供治疗性基因疗法改善患者的生活。”

AAV8和AAV9衣壳蛋白能够靶向身体中的多种肌肉类型,这让AAV介导的基因疗法能够用于治疗多种肌肉疾病,其中包括杜兴氏肌营养不良症。值得一提的是,肌肉可以作为生成治疗性分子的“体内工厂”,因此靶向肌肉组织的基因疗法可以用于治疗非肌肉疾病。

以创造力着称的荷兰公司UniQure成立于2012年,致力于研发基因疗法用于治疗各种因基因缺陷和异常引起的疾病,如遗传病、中枢神经系统失调症等,目前在多个疾病领域都有自己的开发计划。通过与领先的学术机构和研究机构合作的方式来赞助临床前和早期临床试验的候选基因治疗产品,使得UniQure成本效益增大而没有耗费大量资源。创新且模块化的技术平台保证产品安全性和有效性。2014年2月,UniQure走进纳斯达克,正式挂牌上市。

重组AAV递送的基因疗法的另一个重要方向是CNS,包括眼睛和大脑。眼睛是一个相对隔离的环境,直接进行眼内注射递送AAV基因疗法能够达到治疗多种遗传性眼病的效果。Spark
Therapeutics公司开发的获批疗法Luxturna就是治疗由于RPE65基因突变而导致失明的患者。

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而静脉输入的AAV9和AAVrh.10能够穿越血脑屏障,在神经元和胶质细胞中引发转基因表达。这项重大发现带来多项针对CNS疾病的研究,其中包括SMA,肌萎缩侧索硬化症,GM1神经节苷脂病,和粘多糖贮积症III型等等。

uniQure公司研发管线内的5个项目

▲部分干预性AAV基因疗法信息

UniQure公司在欧洲的主要产品是Glybera。作为首款基因治疗药物,Glybera于2012年被欧盟批准上市,用于治疗及其罕见的遗传疾病——脂蛋白脂肪酶缺乏症,创造了100万美元定价的昂贵现代医药的新记录。获批至今,这款天价药仅被使用过一次。

AAV基因疗法策略

2017年10月,UniQure公司再次传来了好消息,公司旗下的亨廷顿舞蹈病的研究治疗已经获得了罕见疗法认证。该药物将有可能成为美国本土首例获得该疾病治疗批准的药物方案。UniQure
曾表示预计将于 2018 年利用该疗法引入临床试验。

基因替代:这一策略的目标是递送表达正常蛋白的基因来弥补功能丧失性突变的影响。它适用于治疗隐性单基因疾病,已经临床试验中获得极大成功。Glybera和Luxturna就是很好的例子。Glybera基于重组AAV1平台递送表达编码脂蛋白脂肪酶的转基因,它用于治疗LPL缺失患者。而Luxturna则使用AAV2平台来递送正常RPE65基因。这两款疗法都使用局部注射的施药方法,分别注射到患者的肌肉和眼睛中。

Sangamo Therapeutics

新一代AAV血清型的发现让研究人员可以通过静脉注射AAV载体将转基因递送到全身。这些新的AAV载体为治疗A型和B型血友病,DMD和SMA带来了有效疗法。本月有望获批的Zolgensma就是一个范例,这是一款利用AAV9载体递送编码运动神经元生存蛋白的SMA转基因的基因疗法。在很多疾病中,只需在部分细胞中表达正常基因就足以缓解疾病的症状。

“释放基因治疗的潜力在于使用正确的钥匙。”

基因沉默:与基因替代相反,基因沉默的目标是治疗由于功能获得性基因突变导致的单基因疾病,例如亨廷顿病。RNAi疗法目前是AAV基因沉默平台的首选策略。然而,与合成RNAi疗法的飞速进展相比,基于AAV递送平台的RNAi疗法目前仍处于临床前开发阶段。基因沉默需要在大部分组织中发生才能够起到有意义的治疗效果,在某些器官中,这对于AAV载体来说还是一个挑战。

Sangamo Therapeutics成立于1995年,原名为Sangamo
BioSciences,是一家通过基因编辑技术开展临床阶段药物研发的公司,专注于锌指蛋白技术的研究开发和商业化。可以说,这家公司是全球应用锌指蛋白技术最广泛的公司,开展了一系列临床阶段的人类疾病治疗。这家公司已在2000年4月在纳斯达克上市,2013年曾完成7420万美元的Post-IPO。

在RNAi策略以外,使用CRISPR-Cas系统来靶向RNA也是一种基因静默的策略。不过这一策略需要克服的障碍是重组AAV容纳的转基因大小有限,而且从细菌中发现的Cas蛋白可能引发免疫反应,从而降低疗效。

基于基因治疗的多平台方法,包括基因治疗、基因组编辑、细胞疗法、基因调控等,Sangamo
Therapeutics在血友病、血红蛋白病、中枢神经系统疾病、艾滋病等领域布局产品管线。其中有6个项目已经进入临床1期试验。

递送新基因:除了治疗单基因疾病以外,AAV介导的基因疗法具有通过递送新基因来治疗复杂遗传病或者传染病的潜力。例如,心力衰竭和传染病代表着具有高度未经需求的疾病领域,通过引入新基因,基因疗法可以提供生长因子,调节与心力衰竭相关的信号通路,以及表达中和致命病毒感染的抗体。目前的临床试验正在检验,使用肌肉作为生成治疗性抗体的“生物工厂”,治疗HIV感染的治疗方法。

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改进AAV载体的手段

Sangamo Therapeutics的产品研发管线

当重组AAV在20多年前第一次表现出作为基因疗法载体的临床活性之后,研究人员就在不断对衣壳蛋白进行改造,试图赋予它新的功能和特征。随着科技的进步,开发新衣壳蛋白的策略也不断演变。

2017年11月,Sangamo
Therapeutics公司宣布其在研疗法SB-913完成了首例患者给药。与目前获批的三款基因疗法不同,这款疗法直接作用于患者体内的生命源代码,引入健康基因。换句话说,当这款基因疗法生效的那一刻,这名患者的基因将就此不同。这是生物技术史上的重要一步!

目前,衣壳蛋白开发的策略可以分为3大类:天然发现,理性设计,和定向进化。随着近年来计算能力和生物信息学预测模型的进展,一个新的衣壳蛋白设计分支出现了。这就是计算机发现策略。下面我们来看一看这些不同策略的优缺点。

▲改进AAV载体衣壳蛋白的四种策略

天然发现

目前最具有临床应用潜力的AAV血清型都是从天然来源中分离出来的。其中的范例就是AAV9,它是从人类肝组织中分离出来的。AAV9具有穿越血脑屏障的能力,这让它成为在中枢神经系统中递送基因疗法的首选衣壳。除了能够感染CNS的AAV血清型以外,天然人类和非人灵长类AAV感染的主要器官为肝脏和脾脏。

然而,使用人类AAV衣壳的一个缺陷是大部分人由于在一生中受到过AAV的感染,导致他们体内携带针对AAV衣壳的抗体。据传染病学统计,40-80%的人体内携带针对AAV的抗体。这可能导致AAV作为基因疗法载体在未递送转基因时就被免疫系统摧毁,降低转基因的表达水平。

解决这一难题的策略包括使用从非人灵长类中分离的AAV衣壳,以及其它脊椎动物中分离的AAV衣壳蛋白。目前,从非人灵长类动物和猪身上获取的AAV衣壳种类在实验中表现出良好的转基因递送能力。

理性设计

理性设计是改良病毒载体衣壳的首选策略之一。最初的改良策略包括将特定多肽序列嫁接在衣壳表面,让它们可以与特定细胞表面的受体相结合。这可以让病毒载体感染原先无法被感染的细胞。

另一个改良病毒载体衣壳的方向是扰乱细胞对衣壳蛋白的降解过程。已有研究表明,通过点突变改变衣壳表面酪氨酸可以在小鼠模型中将转基因在肝细胞中的表达水平提高30倍。这一改变不但抑制了蛋白酶体对AAV衣壳的降解,而且改善了病毒载体在细胞内的运输。

定向进化

由于我们对AAV与细胞表面受体结合,内化,在细胞内运输,以及进行基因表达的生理过程还不够了解,这方面知识的缺陷限制了理性设计的应用。因此,定向进化手段在很多情况下成为优化病毒载体更有效的策略。

定向进化的原则是模拟自然进化的机制,在衣壳蛋白中引入大量随机突变,然后在选择压力下筛选出具有特定生物性质和特征的衣壳。例如,它们可能可以靶向特定组织,或者逃避免疫监控,或者提高转基因的表达。这一策略的优点在于我们不需要对相应的分子机制有深入的了解。

目前,通过容易出错的PCR可以在编码衣壳蛋白的基因中引入大量随机突变,从而建立一个具有丰富多样性的衣壳蛋白库。另一种建立多样性衣壳蛋白库的方法是将不同种类的天然衣壳蛋白中的不同部分随机组合起来构成嵌合衣壳蛋白。

随着下一代测序技术的进步,定向进化手段成为更为强大的发现创新病毒载体衣壳的方法。基于NGS开发的筛选技术如今可以每次对上千种携带不同衣壳的病毒载体进行筛选,从而迅速迭代,发现能够在特定细胞或组织中导致基因表达的衣壳蛋白。

In silico生物信息学发现策略

生物信息学和计算机工具可以通过比较不同AAV的衣壳蛋白序列,推断出衣壳蛋白的进化过程,并且发现衣壳蛋白上具备高度多样性的区域。这可以帮助在这些区域引入变异,与定向进化手段相结合,更有效地筛选出新型病毒衣壳蛋白。

结语

基因疗法是获得业界关注的创新治疗平台。而作为递送转基因的有力手段,AAV载体平台的研发也在出现指数型增长。虽然对AAV的研究属于病毒学领域,但是将AAV转化为基因疗法载体的过程需要多学科的联合研究。分子生物学、生物信息学、传染病学、结构生物学、免疫学、和基因组学等方面的突破对AAV载体平台的成功开发都起到不可或缺的作用。

AAV载体平台的发展仍然需要克服多项挑战,其中包括如何经济有效地生成足够数量的治疗性AAV载体,以及克服人体免疫系统对AAV载体和转基因产物的免疫排斥作用。克服这些挑战对推广AAV介导的基因疗法具有关键性的意义。

我们期待随着AAV研发领域的不断扩展和多学科手段的应用,我们能够克服目前遇到的挑战,实现AAV基因疗法的全部潜力。

参考资料:

[1] Wang et al, (2019). Adeno-associated virus vector as a platform
for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery.

[2] AveXis. Retrieved May 20, 2019,

[3] 372项基因治疗临床试验正在进行中,25个基因治疗药物即将到来.
Retrieved May 21, 2019,

[4] 25 Up-and-Coming Gene Therapies of 2019. Retrieved May 21, 2019,

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